Uredio Peter Sarnow, Medicinski fakultet Univerziteta Stanford, Univerzitet Stanford, Kalifornija, odobreno 25. decembra 2020. (pregledano 25. oktobra 2020.)
Izvještavamo o interakciji između podjedinica u replikaciji korona virusa-transkripcijskih kompleksa, koji su neophodni za replikaciju i evolucijsku konzervaciju.Dali smo dokaze da NiRAN domen povezan sa nsp12 ima aktivnost nukleozid monofosfat (NMP) transferaze u trans, i identifikovali nsp9 (protein koji se vezuje za RNK) kao svoju metu.NiRAN katalizira kovalentno vezivanje NMP ostatka za konzervirani nsp9 amino terminus u reakciji koja se oslanja na Mn2+ jone i susjedne konzervirane Asn ostatke.Utvrđeno je da su aktivnost NiRAN-a i nsp9 NMPilacija bitni za replikaciju koronavirusa.Podaci nam omogućavaju da povežemo ovu aktivnost markera enzima ugniježđenog virusa s prethodnim zapažanjima u hipotezi da je inicijacija sinteze RNK u klasi RNA virusa funkcionalno i evolucijski konzistentna.
RNK-ovisna RNA polimeraza (RdRps) iz Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae i 12 drugih porodica) povezana je s amino-terminalnim (N-terminalnim) domenom u nestrukturnom proteinu (nsp) koji se oslobađa iz poliproteina, nazvanog NiRAN 1ab se sastoji od virusne glavne proteaze (Mpro).Ranije je prijavljena aktivnost GMPilacije/UMPilacije arterijskog virusa NiRAN-RdRp nsp i predloženo je da generiše prolazni proces za prijenos nukleozid monofosfata (NMP) na (trenutno nepoznati) virus i/ili stvari biopolimerizacije stanica.Ovdje pokazujemo da koronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E i Teški akutni respiratorni sindrom Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ima aktivnost NMPilacije zavisnu od Mn2+, koja je izvedena iz nsp9 kroz formiranje Mpro posredovanog nsp9 nakon N-terminalni bočni nsps se proteolitički oslobađa, fosforamidat je vezan za primarni amin (N3825) na N-terminalu nsp9.Uridin trifosfat je preferirani nukleotid u ovoj reakciji, ali adenozin trifosfat, gvanozin trifosfat i citidin trifosfat su također pogodni kosupstrati.Studije mutacija koje su koristile rekombinantne nsp9 i nsp12 proteine korona virusa i genetski modifikovane mutante HCoV-229E odredile su ostatke neophodne za NiRAN posredovanu nsp9 NMPilaciju i replikaciju virusa u ćelijskoj kulturi.Podaci su potvrdili predviđanje ostataka aktivnog mjesta NiRAN i utvrdili važnu ulogu ostataka nsp9 N3826 u nsp9 NMPilaciji i replikaciji virusa in vitro.Ovaj ostatak je dio očuvane N-terminalne NNE tripeptidne sekvence i pokazao se kao jedini invarijantni ostatak nsp9 i njegovih homologa u porodici koronavirusa.Ova studija pruža solidnu osnovu za funkcionalno proučavanje aktivnosti NMPilacije drugih ugniježđenih virusa i predlaže moguće ciljeve za razvoj antivirusnih lijekova.
Nidovirales pozitivno-lančani RNA virus inficira različite kralježnjake i beskičmenjake (1, 2).Redoslijed trenutno uključuje 14 porodica (3), od kojih je porodica Coronavirus opsežno proučavana u posljednjih 20 godina.U to vrijeme, tri zoonoza korona virusa izašla su iz životinjskih domaćina i izazvala velike epidemije teških respiratornih infekcija kod ljudi.Uključujući trajne pandemije uzrokovane teškim akutnim zaraznim bolestima.Respiratorni sindrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirusi dijele zajedničku organizaciju genoma, a podjedinica kompleksa replikacije-transkripcije vezanog na membranu (RTC) je kodirana u 5-?²-terminalnoj dvije trećine i glavnoj strukturnoj podjedinici virusne čestice, kao i u nekim dodacima .Protein, kodiran u 3??² krajnjoj trećini genoma (1).Osim jedne porodice planarnih virusa (Monoviridae) (8), svi ugniježđeni virusi kodiraju RTC podjedinice u dva velika otvorena okvira čitanja (ORF) ORF1a i ORF1b, koji su prevedeni iz genomske RNK.ORF1a kodira poliprotein (pp) 1a, a ORF1a i ORF1b zajedno kodiraju pp1ab.Uz generalno učešće glavne proteaze (Mpro) koju kodira ORF1a, i pp1a i pp1ab se proteolitički obrađuju u razne nestrukturne proteine (nsps), također poznate kao 3CLpro, jer ima homologiju sa 3Cpro pikornavirusa ( 9).Smatra se da su ovi nsps sastavljeni u veliki dinamički RTC, katalizuju sintezu genomske RNK (replikacija) i skupa subgenomske RNK (transkripcija) i koriste se za koordinaciju ekspresije ORF-a koji se nalazi nizvodno od ORF1b (10? ? ?12).
Jezgro RTC uključuje RNA zavisnu RNA polimerazu (RdRp) (13), helikazu superfamilije 1 (HEL1) (14, 15) i nekoliko enzima za obradu RNA, koji su uglavnom kodirani u ORF1b iu porodici koronavirusa. Sadrži nsp12-nsp16 i nsp9-nsp12 u porodici Arterioviridae (vidi referencu 10ââ 12).RdRp i HEL1 predstavljaju dva (jedna petina) očuvana domena virusa ptičjeg gnijezda i imaju homologiju među ostalim RNA virusima.Vjeruje se da jezgra replikaze potpomognuta drugim podjedinicama, uključujući nekoliko malih nsps oslobođenih iz karboksi-terminalne (C-terminalne) regije pp1a, nizvodno od Mpro (koronavirus nsp5 i arterijski virus nsp4, respektivno).Imaju ograničenu zaštitu specifičnu za porodicu i različite aktivnosti (pregledano u referenci 10–12).
Relativno nedavno, domen sa jedinstvenim karakteristikama motiva sekvence pronađen je na amino terminusu (N-terminusu) pored RdRp-a kod svih ugniježđenih virusa, ali ne i kod drugih RNA virusa (16).Na osnovu svoje lokacije i aktivnosti nukleotidne transferaze (nukleozid monofosfat [NMP] transferaze), ovaj domen je nazvan NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Dvodomenska kombinacija NiRAN-RdRp čini nsp12 u porodici Coronaviridae i nsp9 u porodici Arterioviridae, a kod ostalih nestoviridae, očekuje se da će se NiRAN-RdRp osloboditi kao nezavisni nsp iz virusnog poliproteina.Kod koronavirusa, NiRAN domen sadrži ??1/450 ostataka i povezan je sa C-terminalnim RdRp domenom preko linker regiona (16?19).Kod Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), rekombinantni nsp9 pokazuje aktivnosti UMPilacije i GMPilacije zavisne od Mn2+ jona, koje zavise od tri očuvane baze sekvence u nestovirusu, AN, BN i CN, ostaci u sekvenci.Gdje N označava NiRAN) (16).N-terminalni bočni dio ovih motiva je manje konzervativan motiv preAN.Neki od ovih ostataka su također konzervirani u daleko srodnim protein kinazama, gdje se pokazalo da su uključeni u vezivanje nukleozid trifosfata (NTP) i katalitičku aktivnost (20, 21).U skladu s ovim zapažanjem, nekoliko ključnih ostataka aktivnog mjesta u pseudokinazi SelO iz Pseudomonas syringae može se spojiti s nedavno objavljenim superkompleksom SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Konzervirani ostaci NiRAN korona virusa koji se nalaze u elektronskoj mikrostrukturi.Rekombinantni protein (17).Nagađa se da će dokumentirana (samo) U/GMPilacija proizvesti prolazno stanje za prijenos NMP na (trenutno nepoznati) supstrat (16), a strukturna sličnost između NiRAN i protein kinaze (17, 19) ) Da li je hipoteza da NiRAN modifikuje druge proteine.
Mnoge karakteristike, uključujući njegovu jedinstvenu i jedinstvenu sistematsku povezanost sa ugniježđenim virusima i genetsko odvajanje od RdRp-a, čine NiRAN razumnim ključnim regulatornim enzimom za ugniježđene viruse, što je ključno za njihov nastanak i identitet.Ranije su nazivane tri moguće funkcije koje uključuju NiRAN za regulaciju genoma/subgenomske translacije ili replikacije/transkripcije.Uzimajući u obzir oskudne i nepotpune podatke koji su bili dostupni u to vrijeme, svaka funkcija ima svoje prednosti i nedostatke (16).U ovom istraživanju želimo spojiti biokemijske i obrnute genetičke studije koronavirusa koji predstavljaju dva roda i staviti naše nalaze u evolucijsku pozadinu prirodne mutacije porodice koronavirusa, kako bismo stekli uvid u ovo Misteriozno područje.Izvještavamo o velikom napretku u razumijevanju NiRAN-a kroz identifikaciju prirodnih meta u RTC-u, što (među tri dostupne hipoteze) doprinosi ulozi ovog domena u pokretanju sinteze ugniježđene virusne RNK.Ovo istraživanje također otvara mogućnosti za druge uloge NiRAN-a na interfejsu hosta virusa.
Kako bismo okarakterizirali enzimska svojstva NiRAN domene povezane s korona virusom nsp12, proizveli smo rekombinantni oblik humanog koronavirusa 229E (HCoV-229E) nsp12 u E. coli, s His6 oznakom na C-terminusu, i kombinirali protein sa [α32-P ] Inkubirajte zajedno sa NTP u prisustvu MnCl2 kao što je opisano u Materijalima i metodama.Analiza produkta reakcije pokazala je prisustvo radioaktivno označenog proteina koji zajedno migrira sa nsp12 (106 kDa), što ukazuje da koronavirus nsp12 katalizira stvaranje kovalentnih proteina-NMP adukata, prvenstveno formiranih s uridin monofosfatom (UMP) (slika 1A) i B).Kvantitativna analiza je pokazala da se u poređenju sa drugim nukleotidima, intenzitet signala inkorporacije UMP povećao za 2 do 3 puta (slika 1C).Ovi podaci su u skladu s predviđenom aktivnošću NMP transferaze NiRAN domene koronavirusa (16), ali ukazuju na to da su nukleotidne preferencije NiRAN domene koronavirusa i arterijskog virusa različite.
Aktivnost samo-NMPilacije HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) je inkubiran sa označenim [α-32P] NTP u prisustvu 6 mM MnCl2 tokom 30 minuta (pogledajte materijale i metode za detalje).Reakcioni proizvodi su razdvojeni pomoću SDS-PAGE i obojeni Coomassie briljantno plavom bojom.(B) Radioaktivno obilježeni protein se vizualizira pomoću slike fosfora.Položaji nsp12-His6 i markera molekulske mase proteina (u kilodaltonima) prikazani su u A i B. (C) Intenzitet radioaktivnog signala (srednja vrijednost ± SEM) određen je iz tri nezavisna eksperimenta.*P≤0,05.Jačina signala (procenat) je povezana sa UTP.
Iako se pokazalo da su aktivnosti enzima povezane s NiRAN-om bitne za replikaciju EAV-a i SARS-CoV u ćelijskoj kulturi (16), specifična funkcija NiRAN-a i potencijalni ciljevi još nisu utvrđeni.Nedavno objavljena strukturna sličnost između NiRAN i porodice proteina sa naborima sličnim protein kinazi (17, 22) potaknula nas je da testiramo hipotezu da NiRAN katalizira NMPilaciju drugih proteina.Generirali smo skup potencijalnih homolognih meta, uključujući nestrukturne proteine kodirane HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), od kojih svaka sadrži C-terminalnu His6 oznaku (SI dodatak, Tabela S1) i inkubirajte ove proteine sa [α32-P] uridin trifosfatom ([α32-P]UTP) u prisustvu ili odsustvu nsp12.Goveđi serumski albumin i fuzioni protein MBP-LacZα proizveden u E. coli služili su kao kontrole (Slika 2A, trake 1 do 7).Radioaktivno obilježeni protein analiziran je elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela (SDS-PAGE) i autoradiografijom, te je utvrđeno da postoji jak radioaktivni signal u reakciji koja sadrži nsp12 i nsp9.Položaj signala odgovara molekulskoj masi nsp9, što ukazuje na nsp12 posredovanu UMPilaciju nsp9 (slika 2B, staza 7).Nije pronađen nijedan drugi test protein da je UMPiliran, što nas je dovelo do zaključka da je nsp9 specifičan supstrat za nsp12.U skladu sa podacima o samo-NMPilaciji prikazanim na Slici 1, nsp12 može prenijeti sva četiri NMP-a na nsp9, iako je efikasnost različita, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> gvanozin monofosfat (GMP)> citidin monofosfat (CMP) ) ( Slika).3 A i B).U uslovima korištenim u ovom testu (skratiti vrijeme reakcije i izlaganja, smanjiti koncentraciju nsp12; materijali i metode), samo-NMPilacija nsp12 nije mogla biti otkrivena (uporedite sliku 2B, traku 7 i sliku 1B), što pokazao se efikasnim (i više rundi) UMP premješten sa nsp12 na nsp9.Aktivnost UMP transferaze zahtijeva prisustvo Mn2+ jona, kao što je prikazano na slici 3C, dok je samo minimalna aktivnost UMP transferaze uočena u prisustvu Mg2+, a nikakva aktivnost u prisustvu druga dva testirana dvovalentna kationa.Slični podaci dobijeni su u testovima NMPilacije koji sadrže citidin trifosfat (CTP), gvanozin trifosfat (GTP) i adenozin trifosfat (ATP) (SI dodatak, slika S1).
UMPilacija nsp9 posredovana HCoV-229E nsp12.Niz proteinskih supstrata (uključujući goveđi serumski albumin, MBP-lacZα i niz HCoV-229E nsps označenih sa C-terminalom His6 kodiranog sa ORF1a) korišten je za procjenu aktivnosti UMPilacije HCoV-229E nsp12-His6⁺-medija proteina.Inkubirajte protein sa [α-32P] UTP 10 minuta u odsustvu (A) ili prisustvu (B) nsp12 kao što je opisano u materijalima i metodama.Na vrhu A i B prikazan je SDS-poliakrilamidni gel obojen Coomassie Brilliant Blue, a na dnu A i B prikazani su odgovarajući autoradiogrami.Položaj markera molekularne mase proteina (u kilodaltonima) dat je lijevo.Položaj nsp12-His6 (B, vrh) i radioaktivni signal uočen tokom inkubacije nsp12-His6 sa nsp9-His6 (B, traka 7) takođe je naznačen, što ukazuje da [α-32P]UMP na nsp9-His6 (12,9 kDa), što nije uočeno za druge testirane proteine.
HCoV-229E NiRAN-posredovana biohemijska i virološka karakterizacija NMPilacije nsp9.(A i B) Uloga nukleotidnog kosupstrata korištenog u reakciji.Nsp12-His6 i nsp9-His6 se miješaju i inkubiraju u prisustvu različitih [α-32P] NTP-ova u standardnom testu NMPilacije.(A, vrh) Coomassie obojen nsp9-His6 odvojen SDS-PAGE.(A, dolje) Autoradiogram istog područja gela.(B) Relativna aktivnost (srednja vrijednost ± SEM) u prisustvu naznačenog nukleotidnog kofaktora određena je iz tri nezavisna eksperimenta.*P≤0,05.(C) Uloga metalnih jona.Prikazan je standardni test NMPilacije u prisustvu [α-32P] UTP-a i različitih metalnih jona, svaki sa koncentracijom od 1 mM.U C, na vrhu, prikazan je Coomassie obojen nsp9-His6, a u C, na dnu, prikazana je odgovarajuća autoradiografija.Veličina označenog proteina (u kilodaltonima) prikazana je lijevo od A i C. (D) Mutantni oblik HCoV-229E nsp12-His6 koji nosi navedenu aminokiselinsku supstituciju je u [α-32P]UTP, kako je opisano u materijalima i metodama.Radioaktivno obilježeni nsp9-His6 proizveden u reakciji NMPilacije detektuje se fosforilacijskim snimanjem (D, gore).Relativna aktivnost u poređenju sa proteinom divljeg tipa (wt) prikazana je u D, a dno je uzeto kao prosjek (±SEM) iz tri nezavisna eksperimenta.Zvjezdice označavaju zamjene nekonzerviranih ostataka.(E) Titar virusa u supernatantu kulture p1 ćelija dobijen 24 sata nakon infekcije određen je testom plaka.Naznačene su supstitucije kodona u domenu NiRAN modificiranog HCoV-229E mutanta (numeracija ostataka je zasnovana na njihovoj poziciji u pp1ab).Kao kontrola korišten je mutant RdRp aktivnog mjesta s nedostatkom replikacije nsp12_DD4823/4AA.
Kako bismo stekli dublje razumijevanje aktivnog mjesta NiRAN-a i odredili ostatke vezane za aktivnost nsp9-specifične NMP transferaze, izvršili smo analizu mutacija, u kojoj smo zamijenili konzervativne ostatke u NiRAN AN, BN i CN motivima ( 16) To je Ala (SI dodatak, slika S2).Pored toga, uticaj konzervativnih supstitucija Arg-to-Lys ili Lys-to-Arg je procenjen u dva slučaja.Kao (negativna) kontrola, ostaci koji nisu ili manje konzervirani u NiRAN domeni koronavirusa i drugih ugniježđenih virusa zamjenjuju se Ala. Zamjenjujući K4116A (u motivu preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) i D4280A (CN) značajno smanjuju ili čak eliminišu nsp9 NMPilaciju preko nsp12, dok proteini sa konzervativnim supstitucijama (R4178K), K4116R) zadržavaju 60% i 80% svoje aktivnosti, što ukazuje da je relaksacija ograničenja na njihovoj strani lanci su fizičko-hemijski osjetljivi (slika 3D).Zamjena nekoliko drugih konzerviranih ostataka E4145A, D4273A, F4281A i D4283A je mnogo manje štetna, a nsp9 UMPilacija je samo umjereno smanjena.Slični rezultati su dobijeni u reakcijama nsp9 NMPilacije koje uključuju druge NTP (Slika 3D i SI dodatak, Slika S3), potvrđujući da su uočeni efekti na specifične aminokiselinske supstitucije nezavisni od tipa korištenog nukleotidnog kosupstrata.Zatim smo testirali mogući uticaj ovih supstitucija nsp12 na replikaciju koronavirusa u ćelijskoj kulturi.U tu svrhu, koristili smo odgovarajuće genetski modifikovane komplementarne DNK (cDNA) šablone klonirane u rekombinantnom virusu vakcinije (23, 24) za transkripciju 5-7 ćelija.Titracija potomstva infektivnog virusa proizvedenog u ovim ćelijama pokazala je da većina HCoV-229E NiRAN mutanata nije izvodljiva (slika 3E).Grupa neviabilnih virusnih mutanata uključuje alternative za koje se pokazalo da eliminiraju ili značajno smanjuju aktivnost NMP transferaze in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ali postoje dvije druge alternative (K4116R, E41045A) % rezervirano?Njihova in vitro aktivnost NMPilacije sugerira da su uključena dodatna ograničenja.Slično, dvije druge mutacije (R4178K, F4281A) koje su uzrokovale umjereno smanjenje aktivnosti NiRAN in vitro NMPilacije proizvele su žive viruse, međutim, ovi virusi su značajno smanjili titar replikacije.U skladu s podacima o aktivnosti in vitro prikazanim na slici 3D, zamjenom četiri druga ostatka koji nisu konzervirani u koronavirusu i/ili drugim ugniježđenim virusima (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) proizvele su održive viruse. umjereno smanjen titar u poređenju sa virusom divljeg tipa (Slika 3E).
Kako bi se proučilo da li aktivnost NMP-transferaze posredovana NiRANom ovisi o aktivnom RdRp domenu, dva konzervirana Asp ostatka uključena u koordinaciju dvovalentnih metalnih jona (11) u RdRp motivu C zamijenjena su Ala. Rezultirajući protein nsp12_DD4823/4AA zadržava njegova aktivnost nsp9 NMPilacije, što ukazuje da nsp12-posredovana in vitro aktivnost nsp9 NMPilacije ne zahtijeva aktivnost polimeraze (SI Dodatak, Slika S4).
Nakon utvrđivanja nsp9-specifične aktivnosti NMP transferaze za nsp12, pokušali smo okarakterizirati adukt NMP-nsp9 pomoću masene spektrometrije (MS).Kompletan spektar mase proteina rekombinantnog HCoV-229E nsp9 pokazao je maksimum na 12,045 Da (Slika 4A).Dodavanje nsp12 nije promijenilo kvalitetu nsp9, što ukazuje da nsp12 i nsp9 ne bi formirali stabilan kompleks u korištenim uvjetima (denaturacija) (slika 4A).U prisustvu UTP-a i GTP-a, mjerenje mase reakcije koja sadrži nsp9 i nsp12 pokazalo je da se proteinska masa UTP-a pomjerila za 306 Da, a proteinska masa GTP-a 345 Da, što ukazuje da svaki molekul nsp9 vezuje UMP ili GMP (Slika 4) C i D).Nagađa se da energija potrebna za NiRAN posredovanu nsp9 NMPilaciju dolazi od hidrolize NTP i oslobađanja pirofosfata.Iako je u ovoj reakciji korišten 10-struki molarni višak nsp9 (cilja) u odnosu na nsp12 (enzim), uočena je gotovo potpuna NMPilacija nsp9, što ukazuje da je interakcija između nsp12 i nsp9 kratkotrajna i da nsp12 može NMPilirati više nsp9 in vitro molekula.
Pojedinačna NMPilacija nsp9 u prisustvu nsp12 i UTP ili GTP.Prikazan je dekonvolutivni potpuni spektar mase proteina HCoV-229E nsp9 (SI dodatak, Tabela S1) (AD).(A) sam nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 u prisustvu UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 u prisustvu GTP.
Da bi se odredili ostaci nsp9 UMPiliranog nsp12, nsp9-UMP je cijepan tripsinom.Dobijeni peptidi su razdvojeni tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) i analizirani tandem masenom spektrometrijom (MS/MS) na mreži.Analiza podataka korišćenjem softverskog paketa Byonic (Protein Metrics) pokazala je UMPilaciju N-terminalne amino kiseline.Ovo se potvrđuje ručno.Tandem maseni spektar prekursora peptida [UMP]NNEIMPGK (SI dodatak, slika S5A) otkrio je fragment pri 421 m/z, što ukazuje da se UMP vezuje za ostatak 1 nsp9.
Na N-terminusu nsp9, Asn je sačuvan među članovima Orthocoronavirinae (SI dodatak, slika S6).Iako vjerujemo da je primarni aminski dušik N-terminala najvjerovatniji akceptor za UMP, odlučili smo da dobijemo dodatne dokaze vezanja NMP-a na N-terminalu.Iz tog razloga, ne-NMPilirani i NMPilirani N-terminalni peptid nsp9 prečišćen HPLC-om je izveden u prisustvu acetona i natrijum cijanoborhidrida.Pod ovim uslovima, samo slobodni primarni amini mogu biti modifikovani propilom (25).N-terminalni nsp9 peptid sa sekvencom NNEIMPGK sadrži dva primarna amina, jedan na N-terminusu Asn i drugi na bočnom lancu Lys na C-kraju.Stoga se propilne grupe mogu uvesti na oba kraja.Ekstrahovani jonski hromatogrami ne-NMPiliranih peptida prikazani su u SI dodatku, slika S5B.Kao što se očekivalo, mogu se identifikovati N-terminalni i C-terminalni (mono)propilirani (SI dodatak, slika S5B, gornja traka) i dipropilirani peptidi (SI dodatak, slika S5B, donja traka).Ovaj obrazac se mijenja upotrebom NMPiliranog N-terminalnog peptida nsp9.U ovom slučaju, mogu se identificirati samo propilirani peptidi C-terminala, ali N-terminalni propilirani peptidi i dipropilirani peptidi nisu identificirani (SI Dodatak, Slika S5C), što ukazuje da je UMP prebačen na N-terminalni primarni amin kako bi se ovo spriječilo grupe od unošenja promjena.
Zatim zamjenjujemo (sa Ala ili Ser) ili brišemo očuvane ostatke na N-terminusu nsp9 da bismo definirali ciljano-specifična ograničenja.Na osnovu naših MS podataka koji pokazuju da NiRAN formira nsp9-NMP adukt s primarnim aminom N-terminalnog ostatka nsp9, pretpostavili smo da nsp9 NMPilacija zahtijeva virusnu glavnu proteazu (Mpro, nsp5) da oslobodi N-terminal nsp9 iz njegov poliproteinski prekursor.Da bismo testirali ovu hipotezu, proizveli smo prekursorski protein nsp7-11 koji sadrži nsp9 u E. coli i izvršili standardni test NMPilacije u prisustvu [α-32P] UTP (materijali i metode).Kao što je prikazano na slici 5A (traka 3), neprerezani prekursor nsp7-11 nije radioaktivno označen sa nsp12.Nasuprot tome, ako se nsp7-11 odcijepi rekombinantnim nsp5 kako bi se oslobodio nsp9 (i drugi nsps) iz prekursora, detektuje se radioobilježeni protein koji migrira s nsp9, potvrđujući naš zaključak da NiRAN i N-selektivno formiranje kovalentnih nsp9-NMP adukata .Terminalni primarni amin N-terminalnog Asn (pozicija 3825 u pp1a/pp1ab).Ovaj zaključak podržavaju i eksperimenti koji koriste nsp9 konstrukt, koji sadrži jedan ili dva dodatna ostatka na N-kraju.U oba slučaja, NiRAN posredovana UMPilacija nsp9 je ukinuta (SI Dodatak, Slika S7).Zatim smo proizveli protein sa jednim ili dva Asn ostatka izbrisanim iz 3825-NNEIMPK-3832 peptidne sekvence na N-terminalu nsp9.U oba slučaja, nsp9 UMPilacija je bila potpuno blokirana (slika 5B), pružajući dodatni dokaz da pravi nsp9 N-terminus djeluje kao NMP receptor.
Proteolitička obrada nsp9 i uloga N-terminalnih ostataka u UMPilaciji posredovanoj nsp12.(A) nsp9 UMPilacija zahtijeva slobodan nsp9 N-terminal.Nsp7-11-His6 je prethodno inkubiran na 30 °C u puferu za detekciju NMPilacije koji sadrži UTP u prisustvu ili odsustvu rekombinantnog Mpro (nsp5-His6).Nakon 3 sata, započnite test NMPilacije dodavanjem nsp12-His6 kao što je opisano u materijalima i metodama.Reakcija koja sadrži nsp5-His6 (traka 1) i nsp9-His6 (traka 2) korištena je kao kontrola.Nakon 10 minuta, reakcija je prekinuta i reakciona smjesa je odvojena pomoću SDS-PAGE.Protein je obojen Coomassie Brilliant Blue (A, vrh).Prekursor Nsp7-11-His6 i prerađeni proizvod koji nastaje cijepanjem posredovanim nsp5-His6 prikazani su na desnoj strani.Imajte na umu (zbog njihove male veličine) da se nsp7 i nsp11-His6 ne mogu detektirati u ovom gelu, a reakcija je dopunjena nsp5-His6 (staze 1 i 4; pozicija nsp5-His6 je označena punim krugom) ili nsp9-His6 (traka 2) sadrži malu količinu MBP (označeno otvorenim krugovima) kao zaostale nečistoće jer su izražene kao MBP fuzioni proteini (SI dodatak, Tabela S1).(B) Varijanta Nsp9-His6 nema jedan ili dva N-terminalna Asn ostatka (numeracija ostataka prema poziciji u pp1a/pp1ab) i pročišćena je i inkubirana sa nsp12-His6 i [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE obojen Coomassie-om je prikazan na vrhu, B, odgovarajući autoradiograf je prikazan na dnu.Položaj markera molekulske težine (u kilodaltonima) prikazan je na lijevoj strani.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminalni konzervirani ostaci zamijenjeni su Ala ili Ser, a ista količina proteina korištena je u reakciji UMPilacije posredovane nsp12-His6.Reakcioni proizvodi su odvojeni pomoću SDS-PAGE i obojeni Coomassie Brilliant Blue (C, vrh), a radioaktivno obeleženi nsp9-His6 detektovan je fosforescentnim snimanjem (C, sredina).Koristeći protein divljeg tipa (težinski) kao referencu (podešen na 100%), relativna aktivnost NMPilacije (srednja vrijednost ± SEM) izračunata je iz tri nezavisna eksperimenta.(D) Titri virusa u supernatantu p1 ćelijske kulture ćelija Huh-7 inficiranih sa HCoV-229E divljeg tipa Huh-7 ćelija, i mutanti koji nose određene aminokiselinske supstitucije u nsp9 određeni su testom plaka.Kao negativna kontrola korišten je RdRp motiv C dvostruki mutant DD4823/4AA sa nedostatkom replikacije.
N-terminus nsp9 (posebno pozicije 1, 2, 3 i 6) je veoma očuvan među članovima podfamilije Orthocoronavirinae (SI dodatak, slika S6).Da bi se proučila moguća uloga ovih ostataka u nsp12 posredovanoj nsp9 NMPilaciji, dva uzastopna Asn ostatka na N-terminusu nsp9 su zamijenjena sa Ala ili Ser (sam ili u kombinaciji).U poređenju sa divljim tipom nsp9, zamena N3825 sa Ala ili Ser rezultirala je više nego dvostruko smanjenjem UMPilacije posredovane nsp12 (Slika 5C).U skladu s našim zaključkom da se NMPilacija javlja na N-terminalnom primarnom aminu umjesto na bočnom lancu N-terminalnog ostatka, primijetili smo značajnu rezidualnu NMPilaciju zamjenom N3825A i N3825S.Zanimljivo je da ako se drugi Asn zamijeni Ala ili Ser, nsp9 UMPilacija se jače smanjuje (više od 10 puta), dok zamjena Ala na pozicijama 3, 4 i 6 ima samo umjeren učinak na nsp9 UMPilaciju (slika 2 ) .5C).Slični rezultati su dobijeni korištenjem ATP, CTP ili GTP (SI dodatak, slika S8).Zajedno, ovi podaci ukazuju na ključnu ulogu N2826 (pozicija 2 u nsp9) u nsp9 NMPilaciji.
Kako bismo dobili dodatne dokaze o funkcionalnoj korelaciji između N-kraja nsp9 i NMPilacije, izvršili smo višestruko poravnanje sekvenci (MSA) sekvence nsp9 iz porodice Coronavirusa (koja varira između 104 i 113 ostataka) (SI Dodatak, Slika S6).Ukupno, u 47 (poznatih i pretpostavljenih) vrsta od 5 rodova podfamilije Orthocoronavirinae koje inficiraju različite sisare, ptice i reptile domaćine, utvrđeno je da je samo 8 ostataka nepromjenjivo.Najobimnije promjene, uključujući delecije i insercije, uočene su u ciklusima između elemenata sekundarne strukture nsp9, kako je utvrđeno prethodnim strukturnim studijama (26 ??28).Pet nepromjenjivih ostataka pronađeno je u β lancu i α heliksu C-terminalnog dijela nsp9.Tri invarijantna ostatka čine NNE motiv N kraja nsp9.Otkriveno je da je drugi Asn ovog motiva jedini invarijantni ostatak, koji također dijeli hipotetički nsp9 udaljenog žabljeg koronavirusa, a predstavlja vrstu Microhyla letovirus 1 u potfamiliji Letovirinae od Alphaletovirusa.Očuvanje ostataka u elementima sekundarne strukture nsp9 može se racionalizirati strukturnim razmatranjima kako bi se održala savijanja ili poznata svojstva vezanja RNK.Međutim, čini se da se ovo razmišljanje ne odnosi na očuvanje NNE, a prije ove studije, priroda ograničenja koja ograničavaju varijaciju tripeptidne sekvence bila je potpuno nejasna.
Kako bismo utvrdili važnost nsp9-NMPylacije i očuvanja NNE u replikaciji koronavirusa, proizveli smo mutante HCoV-229E, koji nose jednostruke ili dvostruke supstitucije nsp9 N-terminalnih ostataka, što ukazuje da je nsp9 NMPylacija štetna in vitro.Pre nego što počnemo, pokušavamo da odgovorimo na pitanje da li ove zamene (u blizini mesta cepanja nsp8|9) utiču na proteolitičku obradu C-terminalnog pp1a regiona.Skup nsp7-11 poliproteinskih konstrukata koji sadrže odgovarajuće supstitucije na N-terminusu nsp9 proizveden je u E. coli i isječen rekombinantnim Mpro.Na proteolitičko cijepanje četiri mjesta (uključujući nsp9 bočno mjesto) ne utječu značajno nikakve uvedene supstitucije (SI dodatak, slika S9), isključujući strukturne promjene u ovim proteinima koje ometaju Mpro-posredovano cijepanje nsp8|9 (ili drugo) web stranica.
Huh-7 ćelije su transficirane sa HCoV-229E RNA dužine genoma, koja kodira Ala ili Ser supstitucije u očuvanim NNE tripeptidima (N3825, N3826 i E3827) na nsp9 N terminusu, što pokazuje da je većina mutacija fatalna.Uspjeli smo spasiti virus zamjenom Ser ili Ala N-terminalnog Asn (N2835A ili N2835S), ali nismo uspjeli oporaviti virus drugim pojedinačnim i dvostrukim mutacijama u NNE sekvenci (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Slika 5D).
Ovi rezultati ukazuju na to da je replikacija koronavirusa u kulturi tkiva ograničena (ista ili slična), ograničavajući prirodnu mutaciju nsp9 NMPilacijskih mjesta u tijelu i podržavajući ključnu ulogu ovog odgovora u životnom ciklusu koronavirusa.
U posljednjem setu eksperimenata proizveli smo C-terminalni His6 sa oznakom SARS-CoV-2 nsp12 i nsp9, te dva mutantna oblika nsp12 u E. coli.Ostaci aktivnog mjesta u domenima NiRAN i RdRp su umjesto Use Ala (Slika 6A i SI dodatak, Tabela S2).K4465 u SARS-CoV-2 nsp12 odgovara K4135 u HCoV-229E (SI Dodatak, Slika S2), što se pokazalo potrebnim za aktivnost NiRAN i replikaciju HCoV-229E (Slike 3D i E).Ovaj ostatak takođe odgovara ostatku arterijskog virusa EAV nsp9 K94, za koji se ranije pokazalo da je neophodan za samo-UMPilaciju/samo-GMPilaciju NiRAN (16).Kao što je prikazano na slici 6B, SARS-CoV-2 nsp12 ima aktivnost UMP transferaze koristeći nsp9 kao supstrat, dok je mutant aktivnog mjesta nsp12_K4465A neaktivan.Dvostruka supstitucija u SDD karakterističnoj sekvenci RdRp motiva C ne utiče na aktivnost UMP transferaze (slika 6B), što ukazuje da aktivnost RdRp nema direktan efekat na nsp9 UMPilaciju.Slični podaci dobiveni su korištenjem CTP, GTP i ATP (SI dodatak, slika S10).Ukratko, ovi podaci ukazuju da nsp9 NMPilacija posredovana NiRAN-om ima konzervativnu aktivnost u koronavirusima koji predstavljaju različite rodove podfamilije ortokorona virusa.
NMPilacija nsp9 posredovana SARS-CoV-2 nsp12.(A) Coomassie obojen SDS-poliakrilamidnim gelom koji pokazuje rekombinantni protein korišten u testu NMPilacije.Kao kontrola korišćen je mutantni protein sa supstitucijom aktivnog mesta u domenu NiRAN (K4465A) i RdRp domena (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Numeracija ostataka se zasniva na poziciji u pp1ab.(B) Autoradiogram detekcije UMPilacije koristeći nsp9-His6 i [α-32P]UTP kao supstrat nsp12-His6 (divlji tip [wt] i mutant).Molekularna masa (u kilodaltonima) označenog proteina prikazana je na lijevoj strani.
NiRAN domeni su općenito konzervirani u Nidovirales (16), što ukazuje da kataliziraju enzimske reakcije bitne za replikaciju Nidovirusa.U ovoj studiji uspjeli smo dokazati da NiRAN domen koronavirusa prenosi NMP (generiran iz NTP-a) na nsp9, misteriozni protein koji vezuje RNK uključen u replikaciju virusa (26 ?? 29 ), kako bismo ga odredili kao prirodnu metu i partner coronavirus RTC-a.
NiRAN domen dijeli tri motiva sekvence (AN, BN i CN), koji sadrže vrlo mali broj ostataka koji su konzervirani u svim porodicama u monofiletskom, ali visoko diferenciranom redu Nidovirales (8, 16).Nedavne studije su pokazale da su oni strukturno povezani sa uglavnom nekarakterističnom familijom proteina sličnih protein kinazi, koji su prvobitno nazvani SelO familija (17, 19, 22, 30, 31).SelO-srodni proteini imaju nabore kinaze, ali im nedostaje nekoliko konzerviranih ostataka aktivnog mjesta u klasičnim kinazama (22, 32).Na osnovu obrnute orijentacije molekula ATP-a vezanih za aktivno mjesto i stabiliziranih specifičnim interakcijama, za SelO je postavljena hipoteza i naknadno potvrđeno da prenosi AMP (umjesto fosfata) na proteinski supstrat (22), dok drugi bakterijski protein sličan SelO-u ima YdiU nedavno je pokazano da katalizira kovalentno vezivanje UMP-a za Tyr i His ostatke različitih proteinskih supstrata (33).
Kako bismo potvrdili i proširili predviđanje navodnih rezidua aktivnog mjesta NiRAN domene koronavirusa, koristili smo biohemijske i reverzne genetičke metode za analizu mutacije na koronavirusu nsp12 (slika 3D i E i SI dodatak, slika S3 i tabela) S1â S4).Podaci pokazuju da zamjena HCoV-229E K4135, R4178 i D4280 s Ala eliminira in vitro aktivnost NMP transferaze i replikaciju virusa u ćelijskoj kulturi (slika 3D i E i SI dodaci, slika S3), podržavajući njihovo prisustvo u NTP γ-fosfatu (K4135, R4178) i koordinacija aktivnih metalnih jona (D4280).Pokazalo se da zamjena E4145A konzerviranog Glu u rasponu virusa ptičjeg gnijezda za koji je predviđeno da stabilizira položaj K4135 (17) eliminira replikaciju virusa, ali iznenađujuće, aktivnost je zadržana u in vitro testu NMPilacije (Slika 3D i E i SI dodatak, slika S3 i tabele S1-S4).Slično zapažanje je učinjeno kada je odgovarajuća supstitucija uvedena u YdiU homolog Salmonella typhimurium (E130A) (33).Uzeti zajedno, ovi podaci podržavaju regulatornu funkciju ovog konzerviranog ostatka, a ne katalitičku funkciju.
Zamjena konzerviranog ostatka Phe (F4281A) unutar raspona nestovirusa u HCoV-229E NiRAN domeni (8) rezultirala je smanjenjem aktivnosti NMPilacije in vitro i značajnim smanjenjem replikacije virusa u ćelijskoj kulturi (Slika 3D, E i SI) dodatak, slika S3).Podaci su u skladu sa važnom regulatornom funkcijom ovog ostatka, kao što je prethodno prikazani homologni DFG motiv Phe ostatak.U klasičnim protein kinazama, dio je vezne petlje Mg2+ i pomaže u sklapanju i regulaciji kičme???Potreban za efikasnu katalitičku aktivnost (32, 34).Zamjena Ala i Arg za ostatke K4116 (u preAN motivu), respektivno, eliminirala je replikaciju virusa i, kako se očekivalo, imala je različite efekte na aktivnost NMP transferaze in vitro, ovisno o uvedenom bočnom lancu aminokiselina (Slika 3D i E i SI dodaci , Slika S3).Funkcionalni podaci su u skladu sa strukturnim informacijama, što ukazuje da je ovaj ostatak uspostavio interakciju sa ATP fosfatom (17).U NiRAN domenu drugih ugniježđenih porodica virusa, poziciju HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 zauzimaju Lys, Arg ili His (8), što ukazuje da je funkcionalna restrikcija ovog specifičnog ostatka opuštena.Zamjena D4188A i D4283A eliminira ili snažno smanjuje aktivnost enzima i eliminira replikaciju virusa (slika 3).Ova dva ostatka su sačuvana u većini (ali ne u svim) ugniježđenim virusima (8), što ukazuje na važnu funkciju specifičnu za porodicu, ali možda i nekatalitičku funkciju.Ala supstitucije nekoliko drugih Lys i Asp ostataka (K4113A, D4180A, D4197A i D4273A) koje nisu konzervirane u Coronaviridae ili drugim porodicama Nestioviridae (8) korištene su kao kontrole.Kao što se i očekivalo, ove zamjene su uglavnom podnošljive, sa blagim smanjenjem aktivnosti enzima i replikacije virusa u nekim slučajevima (Slika 3 i SI dodatak, Slika S3).Sve u svemu, podaci o mutagenezi koronavirusa vrlo su konzistentni sa podacima o samo-GMP i reverznoj genetici EAV NiRAN-RdRp (16), u kojima EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) ostatak K94 (koji odgovara HCoV-229E K4135) važne funkcije), R124 (odgovara R4178), D132 (odgovara D4188), D165 (odgovara D4280), F166 (odgovara F4281).Osim toga, podaci o mutagenezi HCoV-229E su u skladu i prošireni iz prethodno prijavljenih podataka o obrnutoj genetici SARS-CoV (16), jednako slični onima uočenim za odgovarajući CN motiv Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. opisani fenotip -F219A i HCoV-229E_F4281A (Slika 3 D i E i SI dodatak, Slika S3 i Tabela S1-S4).
U poređenju sa EAV ortolozima (16), koji imaju jasnu prednost za UTP i GTP (u reakciji samo-NMPilacije), naša studija pokazuje da Korona virus NiRAN domen (predstavljen HCoV-229E i SARS-CoV-2) može efikasno prenesena Sva četiri NMP-a, iako postoji mala preferencija za UMP (Slike 1 i 3).Relativno niska specifičnost specifičnog NTP kosupstrata je u skladu s nedavno objavljenom superkompozitnom strukturom SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, u kojoj se ADP-Mg2+ veže za aktivno mjesto NiRAN-a, ali ne i za dio adenina. formiranja specifičnih interakcija (17).U našoj studiji, tip nukleotida koji se koristi u reakciji NMPilacije nema diferencijalni učinak na aktivnost mutantnog proteina (SI Dodatak, Slika S3), što ukazuje da nijedan od ovih ostataka nije blisko povezan sa vezivanjem specifične nukleobaze.Ostaje da se prouči strukturna osnova i potencijalni biološki značaj različitih preferencija supstrata NTP-a uočenih u NiRAN domenima koronavirusa i arterijskih virusa;mogu biti istinite ili mogu biti posljedica ograničenja njihovih studija.Trenutno se ne može isključiti da potencijalna aktivnost NMPylatora NiRAN domene arterijskog virusa (u poređenju s prethodno okarakteriziranom aktivnošću samo-NMPilacije) ima drugačiju preferenciju kosupstrata, uzimajući u obzir da je sličnost između arterijskog i koronavirusa NiRAN domen je na granici.Poređenje zasnovano na sekvenci (16).U poređenju s pseudokinazom SelO, koja koristi Mg2+ kao kofaktor, aktivnost koronavirusa i arterijskog virusa NiRAN ovisi o Mn2+ (16) (Slika 3C i SI dodatak, Slika S1).Ovisnost o Mn2+ i očigledna sklonost UTP-u je neobična karakteristika proteinskih NMPylatora, a tek je nedavno potvrđena u YdiU proteinu Salmonella typhimurium, koji katalizira strogu Mn2+-zavisnu proteinsku šaperonsku UMPilaciju kako bi zaštitila stanice od indukcije stresa. 33).
Nedavno opisana strukturna sličnost između domene NiRAN koronavirusa i ćelijskih protein kinaza (17, 19) pruža dodatnu podršku sposobnosti NiRAN-a da kovalentno poveže NMP s drugim proteinima o kojima smo izvijestili u ovoj studiji.Fokusirali smo našu potragu za mogućim NiRAN ciljevima na proteine kodirane HCoV-229E ORF1a, za koje se zna da direktno ili indirektno pomažu RTC-ovoj ORF1b-kodiranoj replikazi (12, 35).Naši eksperimenti pružaju uvjerljive dokaze za efikasnu i specifičnu NMPilaciju nsp9 (Slika 2).Ako se ciljni protein koristi u molarnom višku koji je 8 do 10 puta veći od enzima (nsp12), potvrđuje se da je nsp9 potpuno (mono)NMPiziran (slika 4).Zaključili smo da je interakcija između nsp12 i nsp9 kratkotrajna i da neće formirati stabilan kompleks sa nsp9 (u odsustvu drugih RTC podjedinica).Ovaj zaključak potkrepljuju studije interakcije proteina na SARS-CoV proteomu (35).MS analiza je identifikovala primarni amin N-terminalnog ostatka nsp9 kao mesto NMPilacije (SI dodatak, Slika S5).Formiranje fosforamidatne veze i N-terminalne amino grupe razlikuje aktivnost NMPilacije posredovanu NiRANom od reakcije AMPilacije posredovane Pseudomonas syringae SelO, koja katalizira formiranje O-vezanog AMP na Ser, Thr ili Tyr ostacima Peptidni adukt ( 22), a S. typhimurium YdiU formira O-vezane (sa Tyr) i N-vezane (sa His) peptidne-UMP adukte.Ograničene informacije dostupne o SelO porodici proteina ukazuju na to da se članovi ove velike porodice proteina uvelike razlikuju u formiranju peptidnih-NMP adukata.Ovo je zanimljivo zapažanje koje zaslužuje dalje proučavanje.
Podaci dobijeni u ovoj studiji doveli su nas do hipoteze da je za NMPilaciju nsp9 potreban slobodan N-terminus.U kontekstu replikacije virusa, ovo će biti omogućeno proteolitičkim cijepanjem mjesta za obradu nsp8|nsp9 u poliproteinu replikaze pp1a posredovanom Mpro i pp1ab.U većini koronavirusa, razlika između ovog specifičnog mjesta (VKLQ|NNEI u HCoV-229E) i svih drugih mjesta cijepanja Mpro koronavirusa je da Asn (umjesto drugog malog ostatka, kao što je Ala, Ser ili Gly) zauzima P1â???Lokacija (36).Podaci o cijepanju peptida dobijeni u ranim studijama pokazali su da je efikasnost cijepanja nsp8|nsp9 mjesta bila niža od one na drugim mjestima, što ukazuje da 1) ovo specifično mjesto može imati regulatornu ulogu u pravovremenoj koordiniranoj obradi C-terminala pp1a region, ili 2) a Uloga posebnog očuvanog nsp9 N-kraja u replikaciji virusa (37).Naši podaci (Slika 5A) su pokazali da je rekombinantni oblik nsp9 koji nosi stvarnu N-terminalnu sekvencu efektivno NMPiziran od strane nsp12.N-terminalna bočna sekvenca je uklonjena faktorom Xa (nsp9-His6; SI dodatak, Tabela S1) ili Mpro-posredovanim cijepanjem (nsp7-11-His6; Slika 5A i SI dodatak, Tabela S1).Važno je da je neprerezani prekursor nsp7-11-His6 koji sadrži nsp9 pokazao otpornost na NMPilaciju nsp12, što je u skladu s našim podacima, što ukazuje da se adukt nsp9-NMP formira preko N-terminalnog primarnog amina (SI dodatak, slika S5) .Da bismo stekli dublje razumijevanje specifičnosti NiRAN supstrata, fokusirali smo se na susjedne N-terminalne ostatke nsp9.U nedostatku drugih proteina, oni su strukturno fleksibilni, sprečavajući ih da budu otkriveni u neobilježenom obliku nsp9 (26 28, 38), što ukazuje na njihovu ograničenu prirodnu varijaciju. To je zbog važne sekvence specifične (ne povezane sa sekundarnom strukturom) funkcija nsp9 N-terminalnog fragmenta.Ala supstitucije konzerviranih ostataka u ovoj regiji (slike 5C i D i SI dodatak, slika S8) otkrivaju da je N3826 bitan za nsp9 NMPilaciju in vitro, dok supstitucije N3825A i E3827A dovode do smanjenja NMPilacije, dok supstitucije M3829A i P38 nemaju .Očigledno utiče na nsp9 NMPylation.Iako supstitucija N-terminalnog Asn (N3825A, N3825S) ima samo umjereni učinak na nsp9 NMPilaciju i replikaciju virusa u ćelijskoj kulturi (Slike 5C i D), brisanje sekvence Asn ostatka iz N-terminalnog 3825-NN dipeptida pokazalo se da je smrtonosan za viruse, što ukazuje da je jedan ostatak Asn potreban prije drugog ostatka na N-kraju, po mogućnosti Asn, iako se čini da se zamjena sličnih ostataka može djelomično tolerirati (Slika 5B, C i D).Zaključujemo da 3825-NN dipeptid, posebno konzervirani i esencijalni ostatak N3826 unutar raspona koronavirusa (SI dodatak, slika S6), osigurava ispravno vezivanje i orijentaciju nsp9 N-kraja u aktivnom mjestu NiRAN.
Zamjena Ala (E3827A) za konzervirani Glu svih potfamilija zadržava nsp9 NMPilaciju in vitro, ali je smrtonosna za viruse u ćelijskoj kulturi (Slika 5C i D), što ukazuje na dodatnu funkciju ovog ostatka, na primjer, u ključnim interakcijama (NMPilirani ili nemodificirani ) nsp9 N-kraj i drugi faktori uključeni u replikaciju virusa.Nsp9 mutacije nisu utjecale na proteolitički proces nsp9 ili bilo kojeg susjednog nsps (39) (SI Dodatak, slika S9), što ukazuje da smrtonosni fenotipovi nekoliko uočenih mutacija nsp9 nisu uzrokovani disregulacijom C proteolitičkog procesa-terminalnog pp1a područja .
Gore navedeni podaci pružaju dokaz da nakon Mpro-posredovanog tretmana mjesta cijepanja nsp8|9 u pp1a/pp1ab, N-terminus nsp9 može biti UMPiliran (ili djelomično modificiran drugim NMP).Osim toga, odlična očuvanost N-kraja nsp9 (uključujući singularne i invarijantne ostatke Asn u porodici koronavirusa) i podaci o obrnutoj genetici dobiveni u ovoj studiji (slike 3E i 5D) doveli su nas do zaključka da je opisana nsp9 NMPilacija je biološki povezan i neophodan za replikaciju koronavirusa.Ostaje da se prouče funkcionalne posljedice ove modifikacije, na primjer, u vezi s prethodno opisanom (nespecifičnom) nsp9 (nemodificirani oblik) RNA vezujuće aktivnosti (2628).N-terminalna NMPilacija takođe može uticati na interakciju nsp9 sa proteinskim ili RNK supstratima ili na formiranje različitih sklopova na četiri nivoa.Oni su uočeni u strukturalnim studijama i potvrđeno je da su funkcionalno povezani s replikacijom koronavirusa, iako posebno u odsustvu U slučaju ove modifikacije (26-ââ29, 40).
Iako ciljnu specifičnost NiRAN domene koronavirusa još uvijek treba detaljnije okarakterizirati, naši podaci pokazuju da je specifičnost cilja proteina NiRAN domene koronavirusa vrlo uska.Iako očuvanje ključnih ostataka aktivnog mjesta (8, 16) u domeni NiRAN svih familija nidovirusa snažno podržava aktivnost konzerviranog NMPylatora ovih proteina, identitet džepnih ostataka koji se vezuju za supstrat ovog domena Preostaje da se okarakteriše. , i mogu se razlikovati između različitih porodica Nidovirales namjena.Slično, relevantne mete drugih ugniježđenih virusa tek treba da budu određene.Oni mogu biti udaljeni ortolozi nsp9 ili drugih proteina, jer su sekvence izvan pet domena replikaze koje su općenito konzervirane u ugniježđenim virusima manje konzervirane (8), uključujući niz genoma između Mpro i NiRAN. Među njima, nsp9 se nalazi u koronavirus.
Osim toga, trenutno ne možemo isključiti mogućnost da NiRAN domen ima dodatne (uključujući ćelijske) mete.U ovom slučaju, vrijedno je spomenuti da se čini da bakterijski homolozi u ovom nastajanju proteina NMPylators (NMPylators) (30, 31) imaju „glavne regulatore“?NMP modulira različite ćelijske proteine da reguliše ili eliminiše njihove nizvodne aktivnosti, igrajući na taj način ulogu u raznim biološkim procesima, kao što su ćelijski odgovor na stres i redoks homeostaza (22, 33).
U ovoj studiji (slike 2 i 4 i SI dodatak, slike S3 i S5), uspjeli smo dokazati da je nsp12 prenio dio UMP (NMP) na jednu (konzerviranu) poziciju u nsp9, dok drugi proteini nisu bili modificirani u Koristi se Pod ovim uslovima, podržana je dobro definisana (a ne labava) specifičnost supstrata.U skladu s tim, u poređenju sa N-terminalnom nsp9 NMPilacijom, vlastita aktivnost NMPilacije nsp12 je vrlo niska, njeno otkrivanje zahtijeva duže vrijeme izlaganja autoradiografiji, a koristi se 10-struko povećanje koncentracije nsp12.Osim toga, naša MS analiza nije uspjela pružiti dokaze za NMPilaciju nsp12, što sugerira da je samo-NMPilacija NiRAN domena (u najboljem slučaju) sekundarna aktivnost.Međutim, treba napomenuti da su druge studije pružile preliminarne dokaze da status samo-AMPilacije bakterijskog NMPylator-a može kontrolirati njihovu aktivnost NMPilacije na drugim proteinskim supstratima (22, 33).Stoga je potrebno više istraživanja kako bi se istražili mogući funkcionalni efekti aktivnosti samo-NMPilacije prijavljenih za EAV nsp9 (16) i koronavirus nsp12 (ova studija), uključujući predloženi efekat sličan chaperonu na savijanje C-terminalnog RdRp domena ( 16) ).
Ranije je razmatrano nekoliko hipoteza u vezi sa mogućim nizvodnim funkcijama nidoviralnog NiRAN domena, uključujući RNA ligazu, RNA-capped gvanilat transferazu i aktivnost pražnjenja proteina (16), ali nijedna od njih nije kompatibilna s dostupnim nizvodnim funkcijama.Informacije dobijene na sljedećim pozicijama su potpuno isto vrijeme bez dodatnih pretpostavki.Podaci dobijeni u ovoj studiji su najkonzistentniji sa (ali ne mogu dokazati) da je NiRAN domen uključen u inicijaciju protein-indukovane RNK sinteze.Ranije se vjerovalo da je funkcija NiRAN domena u 5??²-RNA zatvaranje ili reakcije ligacije RNA nisu pod utjecajem ovih i Podrška drugih podataka.Stoga, na primjer, smatra se da aktivno mjesto NiRAN uključuje konzervirani Asp kao opću bazu (D252 u Pseudomonas syringae SelO; D4271 u HCoV-229E pp1ab; D208 u SARS-CoV-2 nsp12) (SI Dodatak, slika 2 ).S2) (17, 22, 33), dok se kataliza u ATP-ovisnoj RNA ligazi i enzimu za zatvaranje RNA provodi kovalentnim enzimom-(lysyl-N)-NMP intermedijerom, koji uključuje nepromijenjeni Lys ostatak ( 41).Osim toga, izuzetna specifičnost NiRAN-a koronavirusa zasnovana na sekvenci za konzervirane proteinske mete i opuštena specifičnost za NTP kosupstrate (preferira UTP) suprotstavlja se NiRAN-posredovanom enzimu za zatvaranje ili funkcijama sličnim RNA ligazi.
Očigledno, potrebno je puno dodatnog rada da bi se provjerila i, ako se dokaže, razradila moguća uloga nsp9-UMP (nsp9-NMP) u sintezi RNK induciranoj proteinima, što će povezati nekoliko zanimljivih, ali (do sada) izvještaja o kojima je prethodno objavljeno .Izolovana zapažanja.Na primjer, utvrđeno je da kraj negativnog lanca RNK koronavirusa počinje oligo(U) lancem (42, 43).Ovo zapažanje je u skladu s idejom da se sinteza RNK negativnog lanca pokreće vezivanjem UMPiliranog oblika nsp9 za poli(A) rep (okidače), koji može biti promoviran njegovim vezanjem RNK. Aktivnost i/ili interakcija sa još jedan RTC protein.UMP dio koji obezbjeđuje nsp9 može se zatim koristiti kao "prajmer" za oligouridilaciju posredovanu nsp7/8/nsp12, koristeći 3??²-poly(A) rep u genomskoj RNK ili drugu sekvencu koja sadrži oligo (A) služi kao šablon, sličan mehanizmu uspostavljenom za VPg protein picornavirusa (44).Šta ako je prijedlog “nenormativan”????Pokretanje (protein-inducirane) sinteze RNK negativnog lanca pruža vezu sa zapažanjima, što ukazuje da RNA negativnog lanca koronavirusa ima UMP (umjesto UTP) na svom kraju (42), što se smatra da ukazuje na to da nukleinska kiselina Dicer cijepa kraj fosforiliran nepoznatom endonukleazom specifičnom za uridin.Ako se potvrdi, ova hidrolitička aktivnost nukleinske kiseline može pomoći u oslobađanju oligomernog UMPiliranog oblika nsp9 sa 5 ² kraja negativnog lanca u nastajanju.Moguća uloga nsp9 u prajmingu proteina je također u skladu s prethodnim studijama obrnute genetike, koje su pokazale da nsp9 (i nsp8) kritički i specifično djeluju s očuvanim cis-djelujućim RNA elementom blizu trećeg kraja genoma koronavirusa.45).Prema ovom izvještaju, ova prethodna zapažanja sada se mogu preispitati i proširiti kroz dalja istraživanja.
Ukratko, naši podaci su odredili specifičnu aktivnost vlasničke ugniježđene enzimske oznake virusa povezane s RdRp na N-kraju.Kod koronavirusa, ova novootkrivena aktivnost UMPylator/NMPylator posredovana NiRANom koristi se da se oslanja na Mn2+ i susjedne Asn ostatke i uzrokuje stvaranje (niskoenergetskih) fosforamidatnih veza s N-terminalnim primarnim aminom.Putem Mpro-posredovanog cijepanja na mjestu cijepanja nsp8|9, nsp9 meta se može koristiti za NMPilaciju, što ukazuje na funkcionalno spajanje između proteaze i NiRAN domena, koje se proteže do RdRp.Očuvanje ključnih ostataka u aktivnom mjestu nsp12 NiRAN i nsp9 meti, u kombinaciji s podacima dobivenim od dva koronavirusa, uključujući SARS-CoV-2, pruža snažne dokaze da je nsp9 NMPylation korona virus. Konzervativne karakteristike su također ključni korak u replikaciji virusa.Dostupni podaci navode nas na zaključak da je specifična uloga NMPiliranog oblika nsp9 u sintezi RNK inducirane proteinima razuman scenarij za koronavirus i druge ugniježđene viruse, a NiRAN također može ciljati i druge neidentificirane proteine.Regulišite virus.Interakcija domaćina.Ako se potvrdi, učešće proteinskih prajmera u sintezi virusne RNK povećat će afinitet sekvence Mpro/3CLpro i RdRp domena između prethodno otkrivenih koronavirusa i supergrupe slične picornavirusu (9), koje su sada objedinjene u nedavno uspostavljenim Pisoniviriteima ( 46) u kategoriji.
Naši podaci također pokazuju da se osnovne, selektivne i konzervativne aktivnosti enzima identificirane u ovoj studiji mogu koristiti kao mete za antivirusne lijekove.Jedinjenja koja ometaju vezivanje (i naknadnu modifikaciju) očuvanog nsp9 N-kraja u aktivnom mjestu NiRAN-a mogu se razviti u učinkovite i svestrane antivirusne lijekove, pogodne za liječenje životinjskih i ljudskih koronavirusa iz različitih (pod)rodova infekcija , uključujući SARS-CoV-2 i bliskoistočni respiratorni sindrom koronavirus.
Kodirajuća sekvenca proteina koronavirusa proizvedenog u ovoj studiji je amplificirana RT-PCR korištenjem RNK izolirane iz Huh-7 zaraženog HCoV-229E ili Vero E6 inficiranog sa SARS-CoV-2 i umetnuta korištenjem standardnih procedura kloniranja.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ili pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspresioni vektor (SI Dodatak, Tabele S1 i S2).Zamjene pojedinačnih kodona uvedene su mutagenezom usmjerenom na mjesto baziranom na PCR-u (48).Da bi se proizveo MBP fuzioni protein, E. coli TB1 ćelije su transformisane odgovarajućim plazmidnim konstruktom pMAL-c2 (SI dodatak, Tabela S1).Fuzijski protein je pročišćen afinitetnom hromatografijom amiloze i cijepan faktorom Xa.Nakon toga, C-terminalni His6-označeni protein je pročišćen Ni-imobiliziranom metalnom afinitetnom hromatografijom (Ni-IMAC) kao što je prethodno opisano (49).Da bi proizvele ubikvitin fuzioni protein, ćelije E. coli TB1 su koristile odgovarajući plazmidni konstrukt pASK3-Ub-CHis6 (SI Dodatak, tabele S1 i S2) i pCGI plazmidnu DNK koja kodira za ubikvitin specifičnu C-terminalnu hidrolazu 1 (Ubp1).Transformacija (47).C-terminalni His6-označeni protein koronavirusa pročišćen je kako je prethodno opisano (50).
Test samo-NMPilacije HCoV-229E nsp12-His6 izveden je kako je opisano u EAV nsp9 (16).Ukratko, nsp12-His6 (0,5 µM) sadrži 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitola (DTT), 6 mM MnCl2, 25 mM pufera specificirani NTP i 0,17 µM odgovara [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) na 30 °C tokom 30 minuta.U svim ostalim (standardnim) testovima NMPilacije nsp9 NMPilacije posredovane nsp12, reakcioni uslovi su podešeni na sljedeći način: nsp12-His6 (0,05 µM) i nsp9-His6 (4 µM) u prisustvu 50 mM HEPES-KOH (pH8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM označava NTP, a 0,17 µM odgovara [α32-P]NTP.Nakon inkubacije od 10 minuta na 30°C, reakcioni uzorak je pomešan sa SDS-PAGE puferom za uzorke: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerola i 0,005% bromofenola plava.Protein je denaturiran zagrijavanjem na 90 °C tokom 5 minuta i odvojen sa 12% SDS-PAGE.Gel je fiksiran i obojen rastvorom Coomassie Brilliant Blue (40% metanola, 10% sirćetne kiseline, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), obezbojen i izložen fosforescentnom ekranu za snimanje tokom 20 sati (da bi se otkrio nsp12 iz NMPilacije) ili (maksimalno) 2 sata (za procjenu nsp9 NMPilacije).Za skeniranje ekrana korišten je uređaj za snimanje Typhoon 9200 (GE Healthcare), a za analizu intenziteta signala korišten je ImageJ.
Za MS analizu, 1 µM nsp12-His6 i 10 µM nsp9 (bez heksahistidinske oznake) korišteni su u analizi NMPilacije (SI dodatak, Tabela S1) i korištena je povećana koncentracija od 500 µM UTP i GTP.U zavisnosti od njihove koncentracije i očekivanog kvaliteta proteina, HPLC sistem Waters ACQUITY H klase opremljen kolonom MassPrep (Waters) korišćen je za odslađivanje 1 do 10 µL puferovanih proteinskih rastvora na mreži.Osoljeni protein se eluira u elektrosprej ionski izvor Synapt G2Si masenog spektrometra (Vode) kroz sljedeći gradijent pufera A (voda/0,05% mravlja kiselina) i pufera B (acetonitril/0,045% mravlja kiselina), a temperatura kolone je 60 °C i brzina protoka od 0,1 mL/min: eluiranje izokratično sa 5% A tokom 2 minuta, zatim linearni gradijent do 95% B u roku od 8 minuta, i održavanje 95% B još 4 minuta.
Detektuju se pozitivni joni sa opsegom mase od 500 do 5000 m/z.Glu-fibrinopeptid B se meri svakih 45 sekundi radi automatske korekcije odstupanja mase.Koristite softver za instrumente MassLynx sa ekstenzijom MaxEnt1 da dekonvolvirate prosječni spektar nakon oduzimanja osnovne linije i izravnavanja.
UMPilirani HCoV-229E nsp9 digestiran je dodavanjem modificiranog tripsina (Serva) i inkubiran preko noći na 37 °C.Chromabond C18WP spin kolona (broj dijela 730522; Macherey-Nagel) korištena je za odslađivanje i koncentriranje peptida.Konačno, peptid je otopljen u 25 µL vode, koja je sadržavala 5% acetonitrila i 0,1% mravlje kiseline.
Uzorci su analizirani MS pomoću Orbitrap Velos Pro masenog spektrometra (Thermo Scientific).Vrhunski nanoâ HPLC sistem (Dionex), opremljen sa prilagođenim 50 cm montiranim na kraju??75 μm C18 RP kolona prepuna magnetnih kuglica od 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Povežite se na maseni spektrometar na mreži preko Proxeon izvora nanospreja;ubrizgati 6 µL rastvora za varenje tripsina u unutrašnji prečnik od 300 µm ×??1 cm C18 PepMap kolona za predkoncentraciju (Thermo Scientific).Koristeći vodu/0,05% mravlje kiseline kao rastvarač, uzorak je automatski zarobljen i desaliniziran pri brzini protoka od 6 µL/min.
Sljedeći gradijenti voda/0,05% mravlje kiseline (rastvarač A) i 80% acetonitrila/0,045% mravlje kiseline (otapalo B) korišteni su da bi se postiglo odvajanje triptičkih peptida pri brzini protoka od 300 nL/min: 4% B za 5 minuta, zatim 30 A linearni gradijent do 45% B u roku od nekoliko minuta, i linearni porast na 95% rastvarača B u roku od 5 minuta.Spojite kromatografsku kolonu na nanoemiter od nehrđajućeg čelika (Proxeon) i raspršite eluent direktno na zagrijanu kapilaru masenog spektrometra koristeći potencijal od 2300 V. Skeniranje s rezolucijom od 60 000 u analizatoru mase Orbitrap je povezano sa najmanje tri MS/MS skeniranja podataka, dinamički isključena na 30 sekundi, koristeći linearnu ionsku zamku izazvanu disocijacijom ili disocijaciju sudara veće energije u kombinaciji sa detekcijom orbitrapa, Rezolucija je 7,500.
Vrijeme objave: 03.08.2021